南昌大学张琦、武汉大学朱联东联合团队WR｜猪粪厌氧发酵液中溶解性有机物对小球藻的毒物兴奋效应：生理与转录组学响应研究

第一作者：古志强

通讯作者：张琦 副研究员，朱联东 教授

通讯单位：南昌大学，武汉大学

成果简介

• 猪粪厌氧发酵液中的溶解性有机物对小球藻的生长具有毒物兴奋效应。

• 梯级提取技术可高效分离厌氧发酵液中的溶解性有机物。

• 具有促生长与抑制生长作用的关键溶解性有机物组分被鉴定。

• 具有抗氧化活性的溶解性有机物可缓解氧化损伤并维持细胞氧化还原稳态。

• 猪粪厌氧发酵液中的腐殖酸和黄腐酸具有浓度依赖性的双向调控作用。

研究进展

猪粪厌氧发酵液（PMADE）中的溶解性有机物（DOM）对微藻的生理响应具有显著影响，但其具体作用机制尚不明确。本研究首先系统评估了PMADE中DOM对小球藻（Chlorella sp.）生理响应的影响；随后，通过梯级提取技术将DOM分离为五种不同组分，并结合光谱与色谱手段对其进行全面表征；其次，为揭示DOM组分与微藻响应之间的构效关系，我们考察了小球藻在不同浓度下对五种DOM组分的生理响应。结合响应结果与DOM特性，筛选出对藻类生长具有显著影响的关键DOM化合物，并选取其中高丰度组分标准物开展进一步验证实验，评估其单独及联合作用对微藻生长的影响；最后，针对两类具有代表性的DOM组分，我们开展了转录组分析，以解析其调控微藻响应的分子机制。

图1 图文摘要

图2显示在150和500 mg/L COD条件下，Chlorella sp.生长受到显著抑制，主要归因于高浓度NH₄⁺-N（800 mg/L）带来的铵毒胁迫。然而，当COD升至1500 mg/L时，Chlorella sp.生物量显著上升，表明适量DOM可缓解铵毒性并促进Chlorella sp.生长。超过该浓度（2500和4000 mg/L）后，生物量显著下降，4000 mg/L时完全抑制生长，显示高浓度DOM对Chlorella sp.具有毒性作用。同时，150和4000 mg/L COD条件下Chlorella sp.光合活性显著下降，伴随胞内ROS水平上升，反映出氧化胁迫增强。Chlorella sp.通过上调SOD活性应对氧化胁迫，但在极高DOM浓度下（4000 mg/L），SOD活性下降，表明抗氧化系统被压垮。综上，DOM对Chlorella sp.表现出浓度依赖的“毒物兴奋效应”，在低浓度下促进其生长，高浓度则产生抑制。

图2 Chlorella sp.在不同DOM浓度梯度下暴露于PMADE中的生理响应。（a）不同DOM浓度条件下微藻的生长曲线；（b）暴露8天后的Chlorella sp.生物量产率及其比生长速率；（c-e）光合参数[Fv/Fm，ETR和Y(Ⅱ)]；（f）在不同DOM浓度下培养4天和8天时Chlorella sp.细胞内ROS的积累；（g）Chlorella sp.在不同DOM浓度下于第4天和第8天的SOD活性。

为进一步研究PMADE中DOM对Chlorella sp.的影响，本研究从PMADE中分离获得了五个DOM组分。具体包括：乙酸乙酯提取组分（EA，0.21 wt%）、正丁醇提取组分（NB，0.58 wt%）、二氯甲烷提取组分（DM，0.02 wt%），以及经碱溶酸沉并脱盐的腐殖酸（HA，56.56 wt%）和脱盐后的残余上清液DOM组分（RFA，42.64 wt%）。

图3 猪粪厌氧发酵液（PMADE）中五种DOM组分（EA、NB、DM、HA和RFA）的梯级提取流程。该梯级提取包括五个步骤：（1）PMADE的浓缩；（2）依次采用三种有机溶剂进行顺序提取；（3）腐殖酸的分离；（4）提取得到的腐殖酸及残余组分的脱盐处理；（5）样品的浓缩与冷冻干燥。

本研究通过多种光谱及色谱技术系统表征了不同DOM组分的结构和成分特征（图4）。所有DOM组分均含有蛋白质类酰胺、羧酸和芳香族化合物等功能基团。3D-EEM分析显示，腐殖酸和黄腐酸是PMADE中的主要荧光物质，其中腐殖酸主要富集于HA组分，黄腐酸则主要存在于RFA组分，验证了梯级提取方法在DOM分离中的有效性。LC-OCD结果进一步揭示各DOM组分在分子组成上存在显著差异，尤其是低分子量有机酸（LMWA）和低分子量中性物质（LMWN）占比较高，具有良好的生物可利用性，可能作为Chlorella sp.的碳源促进其生长。GC-MS鉴定的物质中，EA和DM组分以烷烃类为主，NB组分则以酯类物质为主。另外，EA组分中酚类化合物占2.38%，而DM组分中有高达12.12%的卤代烷烃。UPLC-MS/MS重点分析了EA与NB组之间丰度差异显著的化合物。两者中均富含氨基酸、肽及其类似物，可被微藻高效吸收利用。此外，两个组分均含有多种具有抗氧化活性的化合物，这些物质可能通过清除自由基、稳定细胞膜结构和增强藻类抗氧化酶活性，在缓解ROS诱导的损伤中发挥重要作用。

图4 DOM提取组分的表征。（a）五种DOM组分的紫外-可见光吸收光谱（UV-vis）；（b）红外光谱（FTIR）显示各DOM组分中主要官能团的特征峰；（c）基于三维荧光光谱（3D-EEM）解析DOM的荧光组分；（d）LC-OCD分析DOM的分子组成；（e）GC-MS鉴定EA、NB和DM组分中的主要有机化合物及其相对含量分布；（f）UPLC-MS/MS检出物质中，“EA与NB”组比较中丰度差异显著的前30种DOM物质。

NB组分对Chlorella sp.的生长呈现浓度依赖型促进效应。特别是在添加100 mg/L NB组分时，最终生物量显著高于对照组，表明其在PMADE中促进Chlorella sp.生长过程中的关键作用。该组分富含LMWA（13.47%）和LMWN（35.26%），这些物质可能增强了Chlorella sp.的代谢活性与生物量产出。EA、HA和RFA组分也对Chlorella sp.同样具有“低促高抑”效应，其中EA组分影响最为显著。在4 mg/L EA浓度下，最终生物量最高，但在较高浓度（20和40 mg/L）下，最终生物量较4 mg/L组显著下降（p<0.001）。与NB组分相似，EA组分中也含有多种LMWN类物质，推测被Chlorella sp.吸收利用。此外，该组分富含抗氧化活性物质，在低浓度（<4 mg/L）下，这些物质可能通过缓解铵毒性诱导的氧化胁迫促进藻类生长。然而，EA组分同时含有潜在毒性物质，尤其是其鉴定出的物质中烷烃类占比高达54.762%，这些烷烃可能穿透细胞膜，在细胞内积累并干扰细胞功能，最终抑制藻类生长。此外，还检测到如己基间苯二酚等酚类化合物，对真核微生物具有抑制作用。植物源生物碱也可能通过抑制光合作用进一步抑制藻类生长。在40 mg/L EA浓度下，Chlorella sp.光合活性受到显著抑制。Fv/Fm显著低于对照组，Y(II)与ETR亦显著下降。LC-OCD和3D-EEM分析发现PMADE中含有大量腐殖酸和黄腐酸，分别富集于HA和RFA组分中。HA和RFA组分均显著促进了Chlorella sp.的生长、光合活性和色素积累。腐殖酸可能通过促进光合色素生物合成提高藻类的光吸收与能量转移效率，还可能作为质体醌的质子转运体增强PS II活性。黄腐酸则可作为替代电子供体与碳源。但在高浓度下，HA与RFA组分的促生作用减弱，原因可能包括腐殖质过量引起的遮光效应及其聚合物在细胞膜上的黏附，干扰细胞通透性与功能。

图5 不同浓度梯度下五种DOM组分对Chlorella sp.生长、光合活性、色素积累及营养吸收的影响。（a1–a5）Chlorella sp.在不同浓度梯度下的五种DOM组分中的生长曲线；（b1–b5）Chlorella sp.在不同DOM浓度梯度下的最大光化学量子效率（Fv/Fm）变化；（c1–c5）第8天Chlorella sp.色素含量；（d1–d5）培养基中总有机碳（TOC）的浓度变化。

标准物质验证实验显示（图6），EA组分中的己基间苯二酚毒性最强，在4 mg/L时即显著抑制Chlorella sp.生长（p<0.01），而在20 mg/L浓度下，4天内导致藻类完全死亡。联合暴露浓度为20.004 mg/L时也显著抑制生长（p<0.001）。这些结果表明，随着EA浓度增加，正负效应物质之间的比例发生改变，最终呈现出典型的“低促高抑”效应。腐殖酸和黄腐酸对藻类生长同样具有“低促高抑”效应。在相同浓度下，腐殖酸的刺激效果强于黄腐酸，在200 mg/L浓度下生物量提升最显著（p<0.001），而黄腐酸在100 mg/L时效果最佳（p<0.001）。然而，在高浓度下，二者的促生长效果下降。另外，在高浓度（腐殖酸400 mg/L；黄腐酸250–500 mg/L）下，两者均促进叶绿素a和b的积累，进一步印证其对色素合成的促进作用。因此，HA与RFA在高浓度下促生作用减弱的主要原因是腐殖酸和黄腐酸浓度升高。

图6 EA、NB、HA和RFA组分中典型溶解性有机物组分的标准物对Chlorella sp.生理响应的影响。EA组分中的己基间苯二酚（a1-a4）；EA组分中的六种混合物质（b1-b4）；NB组分中的α-CEHC（c1–c4）；NB组分中的五种混合物质（d1-d4）；HA组分中的腐殖酸（e1-e4）；RFA组分中的黄腐酸（f1-f4）。

过量ROS积累会破坏细胞结构并削弱细胞功能，导致生长受抑。在特定浓度下，五种DOM组分均显著减缓了220 mg/L NH₄⁺-N诱导的Chlorella sp.胞内ROS生成，并促进了ROS的清除。图7显示，NB组分对ROS水平和MDA含量表现出浓度依赖性的下降趋势。尤其是在100 mg/L浓度下处理10天后，ROS水平（p<0.001）和MDA含量（p<0.001）均显著下降，表明在较高浓度下该组分具有较强的清除ROS能力。与此同时，SOD活性和CAT含量显著下降。这些效应可能归因于以下机制：（1）NB组分中的氧化还原活性成分可通过羧基和酚羟基提供氢原子来清除自由基，从而减轻藻细胞酶促抗氧化系统的负担。类似的抗氧化效应也在HA和RFA组分中观察到，200 mg/L腐殖酸和250 mg/L黄腐酸也显著降低了ROS水平（p<0.05），证实其作为有效抗氧化剂的作用；（2）NB组分可促进类胡萝卜素的合成。与对照组相比，50和100 mg/L NB处理组的类胡萝卜素含量显著升高（p<0.001）；（3）某些DOM组分可能作为可利用的碳源，支持藻细胞的生长与代谢，进而通过非酶促途径促进ROS的清除；（4）NB组分中富含植物激素，被证实可调控微藻的生长、代谢及抗氧化系统。4 mg/L EA组分处理显著降低了Chlorella sp.其ROS水平和MDA含量（p<0.01）。然而，在40 mg/L下，EA组分反而显著升高了Chlorella sp.其ROS水平和MDA含量（p<0.05），这可能归因于其中存在的烷烃类物质和植物源生物碱，它们可诱导过量ROS生成。HA和RFA组分也表现出类似的浓度依赖性趋势。

图7 不同浓度DOM组分对Chlorella sp.抗氧化系统的影响。第10天的ROS水平与MDA含量（a1–a5：a1为EA组分，a2为NB组分，a3为DM组分，a4为HA组分，a5为RFA组分）；第10天的SOD活性与CAT含量（b1–b5：b1为EA组分，b2为NB组分，b3为DM组分，b4为HA组分，b5为RFA组分）。

为揭示Chlorella sp.对不同DOM组分表现出显著差异的生理响应及其分子机制，开展了转录组分析。KEGG通路富集分析显示，EA40（EA=40 mg/L）组中与光合作用及DNA损伤修复相关的差异表达基因（DEGs）显著下调（图8）。其中包括编码PS I（psaH）、PS II（psbP、psbQ、psb27）及光合电子传递链关键组分（petF、petH、petJ）的基因，表明EA40组暴露导致光能捕获效率、能量转化及整体光合能力下降。此外，40 mg/L EA诱导的过量ROS生成引发严重DNA损伤。EA40组中与碳代谢相关的基因显著上调，如促进葡萄糖利用的葡糖激酶基因（glk）及参与海藻糖合成的海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因（otsB），这一代谢转变可能部分解释了EA40组中观察到的适度生长促进现象。相比之下，NB100组涉及营养获取、光合作用、能量代谢、蛋白质合成及降解的DEGs明显上调。首先，胞吞作用及吞噬体形成相关基因显著上调，包括编码关键胞吞机制组件（如VPS4、VPS35及Ras相关蛋白）的43个DEGs以及30个参与吞噬体形成的基因，提示Chlorella sp.对大分子营养颗粒的摄取能力增强。其次，NB100组上调了光合作用及能量产生的核心通路基因，其中与碳固定相关的20个DEGs促进碳水化合物合成，为三羧酸循环（TCA）提供底物。此外，脂肪酸降解通路相关基因及缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸和赖氨酸等多种氨基酸代谢通路的基因均被调控，这些代谢活动通过提供乙酰辅酶A，进一步强化TCA循环和蛋白质合成。对应的TCA关键基因柠檬酸合酶（gltA）和异柠檬酸脱氢酶（IDH1、IDH3）表达显著上调。TCA活性的增强促进NADH和FADH2生成，作为电子供体参与氧化磷酸化（OXPHOS）。电子传递链四大复合物（I-IV）及ATP合酶编码基因的显著上调进一步支持OXPHOS的增强。最后，细胞生长依赖于核糖体介导的蛋白质合成。NB100组中编码核糖体大亚基的49个基因和小亚基的63个基因均显著上调，同时伴随10个核糖体生物发生相关基因表达增强，表明rRNA合成、修饰及与核糖体蛋白组装过程被强化，促进功能性核糖体形成并提升蛋白质合成效率。此外，42个与蛋白酶体成熟相关的DEGs表达上调，增强了蛋白质降解与细胞蛋白质动态平衡的能力。

图8 KEGG的通路富集分析揭示微藻在不同DOM处理下的差异性细胞响应。（a）“EA40 vs.对照组”；（b-c）“NB100 vs.对照组”。

结合生理响应与转录组分析结果，40 mg/L EA组分处理显著抑制了Chlorella sp.的光合作用、DNA复制与修复功能，并引发代谢通路的重编程；相比之下，100 mg/L NB组分处理通过协同激活营养摄取、能量代谢和蛋白质合成与降解等多条关键通路，显著提升了Chlorella sp.的生长能力（图9）。

图9 40 mg/L EA组分与100 mg/L NB组分调控Chlorella sp.生理响应的机制示意图。

本研究揭示了PMADE中DOM对微藻生长具有“毒物兴奋效应”，强调了DOM浓度、组成与微藻生理响应之间的复杂相互作用。基于上述认识，提出以下策略以缓解DOM对微藻培养的不利影响：（1）人工筛选具备高效降解有害DOM能力的优势微生物，构建微藻–细菌共生体系，既可增强污染物降解效率，又可减轻DOM对微藻生长的抑制效应；（2）通过调节pH值或超滤手段选择性去除腐殖酸和黄腐酸，从而减轻其抑制作用，并同步缓解如氨氮毒性等其他污染因子的胁迫。

作者介绍

古志强，南昌大学食品科学与工程专业2022级博士研究生，主要从事畜禽沼液资源化利用研究。以第一作者在Water Research期刊上发表SCI论文2篇。

通讯邮箱：guzhiqiang0719@163.com

朱联东，教授，博士生导师，国家级青年人才、湖北省杰青、湖北省高层次人才等获得者。具有芬兰博士学位，回国前担任芬兰瓦萨能源所与瓦萨大学能源技术系研究科学家、助理教授等职，于2018年全职引进武汉大学资源与环境科学学院，任职教授。主要从事水土生物修复等教学和研究工作，主持欧盟Botnia & Atlantica专项、芬兰文化基金、芬兰富腾基金、芬兰通力基金、国家重点研发计划课题及子课题、国家自然科学基金面上、湖北省杰出青年基金等项目十余项。近年来，在Water Research、Applied Energy、Chemical Engineering Journal等刊物上以第一（通讯）作者发表SCI论文近100篇（中科院1区55篇，IF大于10的论文45篇），出版英文专著1部，主编教材3部，参编中英文专著5部、标准3件。SCI论文总引用次数8000余次、H指数44（Google Scholar统计），4篇第一作者及7篇通讯作者论文入选ESI高被引论文。研究成果曾多次被芬兰Pohjalainen、Ilkka等报纸头版专栏介绍，提交的新污染物相关建议入选中国科协“十大前沿科学问题”，连续入选全球前10万顶尖科学家榜单及全球前2%顶尖科学家榜单。2016年以来先后受邀担任IEEE Access、IET Renewable Power Generation、Energy & Environment、Frontiers in Energy Research等多本SCI/SSCI期刊Associate Editor。

通讯邮箱：ldzhu@whu.edu.cn

张琦，博士，南昌大学副研究员、硕导、博士后，中国藻业协会会员，江西省生态饲养学会理事。2019年入选国家“博士后创新人才支持计划”，2022年入选江西省主要学科学术和技术带头人培养计划--青年人才，2024年入选江西省杰出青年基金项目。主要从事畜禽沼液的微藻生物膜法资源化技术、高效微藻光生物反应器的开发设计与优化相关领域的科研与教学工作。主持国家级项目2项；省部级项目7项；横向5项。以第一/通讯作者在Water Research、Journal of Hazardous Materials、Chemical Engineering Journal等期刊上发表SCI论文24篇【中科院1区/TOP 20篇，IF>10论文15篇】；申请发明专利5项。受邀担任SCI期刊Foods、Frontiers in Microbiology、Frontiers in Energy Research客座编辑，以及水生态学杂志青年编委。

通讯邮箱：zhangqi09300218@163.com

                 zhangqi093115@ncu.edu.cn